dynamic BIOSENSORS heliX cyto Vollautomatisches Laboranalysesystem

Technische Daten

• Produktname: heliX cyto
• Hersteller: Dynamic Biosensors GmbH
• Version: 1.0

Produktinformationen

• Das heliX cyto-System ist für die Einzelzell-Interaktionszytometrie (scIC) konzipiert, um die Bindungskinetik von fluoreszenzmarkierten Molekülen an Zielstrukturen auf Zelloberflächen zeitaufgelöst zu messen.

Anweisungen zur Produktverwendung

Verwendung des HeliXcyto-Chips

• Der heliXcyto-Chip enthält einen einzelnen mikrofluidischen Kanal mit Elektrodenpunkten zur Zellaufnahme und -messung. Achten Sie auf die korrekte Platzierung des Chips und befolgen Sie die Anweisungen zur Zellaufnahme.

Wartungschip

• Verwenden Sie den Wartungschip ausschließlich für Reinigungs-, Test- und Wartungsarbeiten. Vermeiden Sie die Verwendung für Experimente, um Verunreinigungen zu verhindern.

Laufpuffer

• Verwenden Sie während der Messungen den Laufpuffer 1 (RB 1). Ausführliche Informationen finden Sie im Datenblatt zur scIC-Kompatibilität im Haupthandbuch.

Sensorgrammanalyse

• Überwachen Sie das Sensorgramm während der Messungen in Echtzeit mit der heliOS-Software. Analysieren Sie die Fluoreszenzreaktion im Zeitverlauf, um kinetische Raten zu ermitteln.

Passivierung

• Erwägen Sie die Verwendung einer Passivierung als optionalen Schritt, um die Adsorption von Analyten zu verhindern, indem Sie ein Passivierungsreagenz auf dem Chip inkubieren.

Normalisierung

• Die Normalisierung ist ein Verfahren zur Standardisierung von Daten für Vergleich und Analyse. Befolgen Sie die Normalisierungsverfahren gemäß der Bedienungsanleitung.

EINFÜHRUNG

• Dieser Leitfaden ist als kurzer Überblick gedachtview des heliXcyto-Systems und seiner Funktionen. Alle Kapitel werden im Hauptleitfaden von heliXcyto ausführlicher beschrieben, der unter folgender Adresse zu finden ist: https://www.dynamic-biosensors.com/helios-download-latest/

heliXcyto Terminologie Einzelzell-Interaktionszytometrie

• Bei der Einzelzell-Interaktionszytometrie (scIC) handelt es sich um eine Technologie, die die Bindungskinetik eines fluoreszenzmarkierten Moleküls (Analyt) an ein Ziel (Ligand) auf der Zelloberfläche misst, indem sie das Fluoreszenzsignal zeitaufgelöst aufzeichnet.

Analyt

• Der Analyt ist ein fluoreszenzmarkiertes Molekül in einer mobilen Phase, das an ein Ziel auf der Oberfläche einer Zelle binden kann.

Ligand

• „Ligand“ ist die Bezeichnung, die in der heliOS-Software für ein Zielmolekül auf der Zelloberfläche verwendet wird, an das ein Analyt binden kann. Dies kann ein Rezeptormolekül, ein Lipid, ein Zucker oder ein anderes Zelloberflächenmolekül sein.

Zellfalle

• Zellfallen sind strömungsdurchlässige, biokompatible Polymerkäfige auf einem HeliXcyto-Chip. Sie dienen dazu, Zellen unterschiedlicher Größe (ca. 6 bis 25 µm) im Strömungskanal zu fangen und zu immobilisieren. Zellfallen sind in drei verschiedenen Größen erhältlich: klein, mittel und groß.

heliXcyto Chip

• Die heliXcyto-Chips enthalten einen einzelnen mikrofluidischen Kanal mit Öffnungen an beiden Seiten. Zwei goldene Elektrodenpunkte befinden sich in der Mitte des Kanals.
• Eine Stelle dient als Referenzstelle, die zweite Stelle enthält biokompatible 3D-Polymerkäfige zur Zellfixierung und dient als Messstelle. Die Messstelle kann ein oder fünf Käfige desselben Typs enthalten.
• Der Referenzpunkt ermöglicht die Echtzeit-Referenzierung des erfassten Fluoreszenzsignals. Der heliXcyto-Chip ist wiederverwendbar und kann auch als Einwegprodukt verwendet werden.

Wartungschip

• Der Wartungschip ist ein einkanaliger mikrofluidischer Chip, der für alle Reinigungs-, Test- und Wartungsarbeiten verwendet wird.
• Diese Vorgänge umfassen die Reinigungs- und Ruheroutine, die Aufwach- und Vorbereitungsroutine, die Systemreinigung und den Fluidiktest. Dieser Chip sollte nicht für Experimente mit Zell-/Proteinlösungen verwendet werden, um eine weitere Kontamination des Chips zu vermeiden.

Laufpuffer

• Der Laufpuffer ist der Puffer, der während der Messung im HeliXcyto verwendet wird. Im Allgemeinen wird die Verwendung von Laufpuffer 1 (RB 1) empfohlen.
• Weitere Informationen entnehmen Sie bitte dem scIC-Kompatibilitätsblatt im Haupthandbuch.

Sensorgramm

• Ein scIC-Sensorgramm ist eine Darstellung der Fluoreszenzreaktion in Zählungen pro Sekunde (cps) über einen bestimmten Zeitraum und veranschaulicht den Verlauf einer Interaktion auf oder in Zellen. Diese Kurve kann viewed in Echtzeit in heliOS während der Messung.
• Bei der Analyse von Sensorgrammen wird die am besten passende Exponentialfunktion für die beobachteten Fluoreszenzsignale ermittelt und die kinetischen Raten (kon, koff) extrahiert.

Passivierung

• Die Passivierung ist ein optionaler Schritt im Lauf. Dabei wird ein Passivierungsreagenz auf den Chip injiziert und inkubiert, um die Oberflächen zu blockieren. Dies kann dazu beitragen, die Adsorption von Analyten an den Chipmaterialien zu verhindern.

Normalisierung

• Um geringfügige Signalunterschiede auszugleichen, die durch die separate Signalerfassung an jedem Messpunkt mit einem separaten Detektor entstehen, wird ein Normalisierungsschritt durchgeführt. Zu Beginn des Assays wird ein Fluoreszenzfarbstoff mit definierter Konzentration (basierend auf der höchsten Analytkonzentration und dem Markierungsgrad des Analyten) injiziert. Dieser Normalisierungsschritt ist automatisch in die Messmethode integriert, und der gemessene Normalisierungspeak dient zur automatischen Korrektur von Unterschieden zwischen den Detektoren während der Datenanalyse vor der Echtzeit-Referenzierung.

scIC-Messprinzipien

scIC-Anwendungen

• Die Einzelzell-Interaktionszytometrie (scIC) misst die Kinetik und Affinität eines fluoreszenzmarkierten Analyten, der direkt auf lebenden Zellen an sein Zielmolekül bindet bzw. sich davon löst.
• Der Nachweis von Analyten in scIC ist größenunabhängig und daher für jedes Molekül von sub-nm bis > 100 nm relevant und gilt für alle Molekülklassen von kleinen Molekülen, Peptiden, Aptameren, Nanobodies, Affibodies, Antikörpern, bispezifischen Antikörperformaten, Proteinen, Proteinkomplexen bis hin zu Vesikeln (Exosomen), Lipidnanopartikeln und Viren.

Die scIC-Technologie kann folgende Anwendungsbereiche abdecken:

• Signalmessung ampGrößen in Bindungsschirmen
• kinetische Analyse der Kon- und Koff-Raten
• Affinitäts- und Aviditätsbewertung mittels Koff- und biphasischen Fit-Modellen
• Spezifitätstests
• relative Quantifizierung von Membranproteinen auf der Zelloberfläche
• Epitop-Binning- und Wettbewerbsstudien
• Hemmtests
• Beurteilung der Internalisierung von Zielproteinen

heliXcyto-Hardwarefunktionen

Fluidsystem

• Das Fluidsystem des heliXcyto wird von bis zu 3 verschiedenen Pufferflaschen gespeist, wodurch Variationen im Betriebs- und Wartungspuffer möglich sind. Die Pumpen im heliXcyto können auf Flussraten zwischen 20 und 500 µL/min eingestellt werden, um unterschiedliche Anforderungen zu erfüllen.ampe und Assay-Anforderungen. Der Flusskanal des Chips ist über zwei Öffnungen mit dem Fluidsystem verbunden. Die linke Öffnung ist mit der s verbundenampDie Öffnung auf der rechten Seite ist mit der Puffer- und Waschleitung verbunden, während die Öffnung auf der rechten Seite mit der Regenerationsleitung verbunden ist.
• Dieses bidirektionale Fluidiksystem ermöglicht die stabile Zellerfassung während der Durchführung verschiedener Messschritte und schließlich die Chipregeneration zur Wiederverwendung des Chips während des Assays.
• Abbildung 1. Chipintegration in einem Fluidiksystem

Optisches System

• Das Fluoreszenzsignal wird durch rote und grüne Leuchtdioden (LEDs) angeregt und durch vier Einzelphotonenzähler detektiert, die rote und grüne Signale von jedem Punkt über die gesamte Kanaltiefe erfassen.
• Zwei unabhängige Signale können gleichzeitig an derselben Messstelle überwacht werden, wodurch in einem Zweifarben-Assay-Aufbau zwei Interaktionen gleichzeitig gemessen werden können.
• Abbildung 2. Optikaufbau
• Die Signalerfassung an jedem Messpunkt erfolgt über einen separaten Detektor. Dies kann zu geringfügigen Abweichungen in den Rohdaten führen. Um dies zu berücksichtigen, wird bei der Datengenerierung automatisch ein Normalisierungsschritt durchgeführt.
• Zusätzlich zu den Einzelphotonenzählern ist das Gerät mit einer CCD-Kamera und einem Auflichtmikroskop ausgestattet. Diese Instrumente ermöglichen die Echtzeit-Bildgebung von Zellen und somit die Beurteilung der Zellintegrität und der Analytqualität während der gesamten Messung.
• Dieses kombinierte System gewährleistet, dass sowohl die Wechselwirkungen als auch die biologischen Bedingungen erfasst werden und ermöglicht so eine umfassende Auswertung des Experiments.

scIC-Workflow

Der scIC-Messprozess lässt sich in drei Hauptschritte unterteilen.

1. Experimentelles Design in heliOS: Jede Messung beginnt mit der Versuchsplanung in der heliOS-Software. Der Assay-Workflow wird durch Auswahl vordefinierter Methoden und Anpassung experimenteller Parameter wie der verwendeten Zelllinie, der Analytkonzentration und der Pufferbedingungen eingerichtet. heliOS berechnet automatisch die exakten Mengen an Zellen, Analyten, Puffern und anderen für die Messung notwendigen Lösungen und optimiert so die Vorbereitung.
2. Vorbereitung von Puffern, Analyten und Zellen: Nachdem das Versuchsdesign finalisiert ist, werden die benötigten Materialien gemäß den Vorgaben von heliOS vorbereitet. Puffer, Analyten und Zellen werden automatisch in das Gerät geladen.amplesen.
3. Messung und Datenanalyse: Das System führt die geplante Reihe automatisierter Echtzeit-Interaktionsmessungen durch, ohne dass ein weiteres Eingreifen des Benutzers erforderlich ist. Die Daten können bereits während der laufenden Messung analysiert werden, um sofortige Einblicke in die Ergebnisse zu gewinnen.

scIC-Assays in heliOS

Neben datengenerierenden Tests bietet die Software auch Methoden zum Testen von Chips, zur Reinigung und zur Gerätewartung.

Tabelle 1. Verifizierte datengenerierende Assays

scIC Kinetik	Es werden vollständige Kinetiken an Zellen mit einer zwischen 1 und 5 Konzentrationen einstellbaren Analytenassoziation gemessen, gefolgt von einer einzelnen Dissoziation nach der höchsten Konzentration. Entweder grüner oder roter Kanal. Enthält eine Option für einen Test nur mit Analyten.
scIC Kinetics – Zweifarbig	Misst die vollständige Kinetik an Zellen mit einstellbarer Analytenbindung zwischen 1 und 5 Konzentrationen, gefolgt von einer einzelnen Dissoziation nach der höchsten Konzentration. Grüner und roter Kanal können gleichzeitig aktiviert werden. Enthält eine Option für einen reinen Analytentest.
scIC-Dissoziation – Zweifarbig	Misst die Dissoziation eines Analyten aus Zellen, die mit einem fluoreszenzmarkierten Analyten mit grünem und/oder rotem Kanal vorinkubiert wurden.

Vorbereitungen und Assay-Entwicklung für die scIC-Messung

Vor der Einrichtung einer scIC-Messung sind einige Punkte zu beachten.

• Analytkonzentration, Markierungsgrad, Eigenschaften und Qualität.
• Normalisierungslösung und Erregerleistung.
• Zellqualität und -handhabung.

Analytkonzentration und Markierungsgrad

• Gemäß den üblichen kinetischen Messverfahren empfehlen wir für die Kinetik mehrerer Konzentrationen einen molaren Analytkonzentrationsbereich zwischen dem 0.1- und 10-fachen der erwarteten Gleichgewichtsdissoziationskonstante (Kd). Für Kinetik- oder Dissoziationsmessungen mit einer Konzentration sollte die Analytkonzentration zwischen dem 1- und 10-fachen des erwarteten Kd-Werts liegen. Das erforderliche Analytvolumen beträgt bei einer 10-minütigen Assoziationszeit und einer Flussrate von 25 µl/min ca. 300 µl.
• Der Markierungsgrad (DOL) für einen Analyten sollte idealerweise 1 betragen, DOL-Werte von 2 oder 3 sind jedoch noch akzeptabel. Beachten Sie jedoch, dass eine höhere Anzahl von Markierungen auf einem Analyten dessen Bindungseigenschaften beeinträchtigen und die Wahrscheinlichkeit von Aggregation oder unspezifischer Bindung erhöhen kann. Um einen optimalen DOL zu erreichen, befolgen Sie das Protokoll der Markierungskits mit rotem oder grünem Farbstoff aus der heliXcyto-Reagenzienreihe.
  Normalisierung
• Die Normalisierung ist der erste Schritt aller datengenerierenden Methoden. Sie kompensiert die geringfügigen Signalschwankungen, die durch die Verwendung separater Detektoren für jeden Messpunkt entstehen. In diesem Schritt wird zu Beginn des Assays ein Fluoreszenzfarbstoff in einer benutzerdefinierten Konzentration injiziert.
• Die Konzentration der Normalisierungslösung wird berechnet, indem die höchste fluoreszenzmarkierte Analytkonzentration, die bei der Messung verwendet wurde, mit dem Markierungsgrad (DOL) des Analyten multipliziert wird. Diese Konzentration bestimmt die während der Messung verwendete LED-Anregungsleistung. Ziel ist es, dass der Peak der Normalisierungslösung ungefähr das gleiche Fluoreszenzsignal erreicht amplititude als höchste Analytkonzentration.
• Die Anfangswerte entnehmen Sie bitte der Tabelle zur Konzentration der Normalisierungslösung im Haupthandbuch. Beachten Sie, dass die Tabelle lediglich die Anfangseinstellungen vorgibt; die LED-Anregungsleistung kann jedoch während der Assayentwicklung weiter angepasst werden.

Zellqualität und -vorbereitung

• Die Zellviabilität sollte über 95 % liegen, und die Zellen sollten sich allgemein in einem guten Zustand befinden. Für adhärente Zellen empfehlen wir die Verwendung von Zellen mit einer Konfluenz von 50–70 %.
• Für Suspensionszellen empfehlen wir die Ernte in der mittleren logarithmischen Wachstumsphase. Pro Ansatz werden 50 µl Zellsuspension mit einer Konzentration von 1E+06 Zellen/mL benötigt.

Ernte von Suspensionszellen

1. Zentrifugieren Sie ca. 2 × 06⁶ Zellen 7 Minuten lang bei 300 g, um das Zellkulturmedium zu entfernen. Verwerfen Sie den Überstand.
2. Waschen Sie die Zellen einmal, indem Sie das Zellpellet in ca. 1 ml DPBS resuspendieren. Zentrifugieren Sie die Suspension 5 Minuten bei 400 g, um die lebenden Zellen zu pelletieren. Verwerfen Sie den Überstand vorsichtig, um Zellfragmente und Medium zu entfernen.
3. Die Suspension vorsichtig in 1 ml DPBS resuspendieren, auf ein Zellsieb geben und durch Schwerkraft filtern.
4. Messen Sie die Zellkonzentration der filtrierten Suspension und stellen Sie sie auf 1E+06 Zellen/mL ein.
   • TIPP: Manche Suspensionszellen neigen zur Aggregation. Diese Aggregate sollten vorsichtig resuspendiert und vor dem ersten Zentrifugationsschritt durch Sieben der Zellen abfiltriert werden.
   • Verwenden Sie Pipettenspitzen mit großem Durchmesser beim Umgang mit Zellsuspensionen, um hohe Scherkräfte beim Transfer oder Resuspension zu vermeiden.

Ernte von adhärenten Zellen

1. Waschen Sie die Zellen mit sterilem DPBS.
2. Lösen Sie die Zellen mithilfe Ihres bevorzugten Dissoziationsreagenz (z. B. TrypLE) vom Kulturkolben.
3. Die dissoziierten Zellen in dem gewünschten Volumen an Medium resuspendieren und mit einem 30-nm-Zellfilter filtrieren.
4. Bei stark adhärenten Zellen kann optional EDTA hinzugefügt werden (Endkonzentration 5 mM).
5. Die Zellen 7 Minuten lang bei 300 g zentrifugieren, um das Zellkulturmedium zu entfernen. Den Überstand verwerfen.
6. Die Zellen in 1 ml DPBS resuspendieren.
7. Messen Sie die Zellkonzentration und stellen Sie sie auf 1E+06 Zellen/ml ein.
   • TIPP: Zellmedien verdünnt 1:4 mit DPBS können verwendet werden, um Nährstoffe zu Zelle s hinzuzufügenamples im Fall empfindlicher Zellen oder langer Assay-Arbeitsabläufe.

Zellfixierung

1. Zentrifugieren Sie bis zu 10E+06 Zellen 7 Minuten lang bei 300 g, um das Zellkulturmedium zu entfernen. Verwerfen Sie den Überstand.
2. Das Zellpellet in 1 ml PBS resuspendieren, zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
3. Das Zellpellet wird in 500 µL PBS/2% PFA (62.5 µL 16% PFA-Lösung + 437.5 µL PBS) resuspendiert.
4. Die Zellen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren (unter gelegentlichem, leichtem Schütteln).
5. Geben Sie 500 µL PBS hinzu und zentrifugieren Sie die Suspension 5 Minuten lang bei 400 g, um das PFA zu entfernen.
6. Verwerfen Sie den Überstand.
7. Die Zellen in 1 ml PBS resuspendieren, durch einen 30 µm Zellfilter filtrieren, zentrifugieren (400 g, 5 min) und den Überstand verwerfen.
8. Die Zellen in etwa 1 ml PBS resuspendieren (optional: auf eine Endkonzentration von 5E+06 Zellen/ml einstellen).
9. Fixierte Zellen bei 2-8°C lagern und innerhalb eines Monats verbrauchen.
   • Falls mehr Zellen repariert werden sollen, erhöhen Sie bitte alle Mengen entsprechend.
   • NOTIZ: Die Zentrifugationsgeschwindigkeit bei der Zellernte kann an den Zelltyp angepasst werden; sind die Zellen empfindlich, werden üblicherweise niedrigere g-Kräfte verwendet.
   • Die PFA-Konzentration kann zwischen 0.5 und 4 % variieren.

scIC-Assay-Setup

Die folgenden scIC-Assays sollten in die Assayentwicklung einbezogen werden und können später im Rahmen von Assay-Workflows wiederholt werden.

Der Arbeitsablauf der Assayentwicklung ist in 3 aufeinanderfolgende Schritte unterteilt:

1. Cyto-Chip-Test
2. Test nur mit Analyten
3. Kinetik-Assay

Cyto-Chip-Test

• Die Qualität eines neuen Chips muss vor der Verwendung eines Cyto-Chips für eine Messung geprüft werden. Führen Sie zunächst einen separaten Cyto-Chip-Test durch. Informationen zur Einrichtung und Auswertung eines Chip-Tests finden Sie im Kapitel „Helix Cyto-Chip“ in der Hauptanleitung.

Nur-Analyt-Test

• Die Entwicklung eines scIC-Assays beginnt mit einem Analyten-Only-Test, bei dem das Verhalten von fluoreszenzmarkierten Analyten auf einer frischen Chipoberfläche ohne Zellen bewertet wird.
• Dieser Test kann regelmäßig wiederholt werden, um die Stabilität markierter Analyten zu beurteilen. Der scIC-Analyt-Only-Test kann in Kinetik-Assays konfiguriert werden, indem das Kontrollkästchen „Nur Analyt“ unter den Zelleinstellungen aktiviert wird.
• Für die Beurteilung der Analytqualität ist die höchste verwendete Konzentration ausreichend und kann durch Deaktivierung aller bis auf eine der Assoziationen im Test konfiguriert werden.

Einrichtung des Arbeitsablaufs für Kinetiktests

• Die Kinetikanalyse wird üblicherweise in einem automatisierten Arbeitsablauf eingesetzt, der sowohl datengenerierende Analysen als auch Wartungselemente umfasst. Sobald der Analyt die Qualitätskontrolle (nur Analyt) bestanden hat, kann er für Messungen an Zellen verwendet werden.
• Um kinetische Raten zuverlässig zu quantifizieren, sollte die Signalantwort während der Assoziation konzentrationsabhängig sein und mit steigender Analytkonzentration zunehmen.
• Die höchste Konzentration sollte ein Plateau erreichen, was auf das Erreichen eines Bindungsgleichgewichts hinweist. Die Dissoziation muss lange genug durchgeführt werden, um einen signifikanten Anteil des gebundenen Analyten (mehr als 5 %) abzulösen und so eine zuverlässige Kurvenanpassung zu ermöglichen.
• Verwenden Sie die Standardparameter in den Testbedingungen als Ausgangspunkt und passen Sie diese je nach Ihren Ergebnissen weiter an.

Example 1. Empfohlener Assay-Workflow

Der Arbeitsablauf der Analyse ermöglicht es den Anwendern, Mess- und Wartungsmethoden entsprechend ihren spezifischen experimentellen Anforderungen in eine Warteschlange zu stellen.

Ein Testablauf kann die folgenden Schritte in der angegebenen Reihenfolge umfassen:

1. Prime (Wartungschip)
2. scIC-Kinetik (Zellen A, Analyt A, Cyto-Chip)
3. Systemwäsche (Wartungschip)
4. scIC-Kinetik (Zellen B, Analyt A, Cyto-Chip)
5. Systemwäsche (Wartungschip)
6. Analyt-only konfigurierte scIC-Kinetik (Analyt A, Cyto-Chip)
   • Die Schritte Prime und System Wash werden auf einem Wartungschip durchgeführt. Ein System Wash wird beim Wechsel zu einer anderen Zelllinie und vor der Durchführung des Analyten-Tests am Ende des Arbeitsablaufs durchgeführt.
   • Weitere Einzelheiten finden Sie im Abschnitt über die Reinigung des Cyto-Systems im Haupthandbuch.
   • Bei der Durchführung von Kinetik-Assays an Zellen sollte die Zellviabilität berücksichtigt werden, die von der Zelllinie abhängt.
   • Für empfindliche Zelllinien wird empfohlen, pro Assay-Workflow nur 1–2 Assays durchzuführen. Für robustere Zelllinien können zusätzliche Assays in die Warteschlange gestellt werden.
   • NOTIZ: Für weitere Tests bereiten Sie die Zelllösung in separaten Fläschchen vor, indem Sie die Zellen unterschiedlich benennen.
   • Stellen Sie sicher, dass alle Reagenzien frisch sind und durch einen 0.22 µm-Filter filtriert wurden. Geben Sie die vorbereiteten Reagenzien anschließend gemäß den Anweisungen von heliOS in das Gerät.
   • Der Lauf kann durch Anklicken des blauen Pfeils mit der Aufschrift „Start“ und Befolgen der Schritte im Assay-Startassistenten gestartet werden.
   • Sobald der Lauf gestartet wurde, arbeitet das Gerät selbstständig, bis der gesamte Testablauf abgeschlossen ist.

Analyse von scIC-Experimenten

Workflow zur scIC-Analyse

• Die Daten von scIC können sich von Standard-Biosensordaten unterscheiden, da die Vorgänge auf den auf der Oberfläche des heliXcyto-Chips erfassten Zellen naturgemäß komplexer sind, was zu Unregelmäßigkeiten im Sensorgramm führen kann.
• Daher wird besonderer Wert auf die Qualitätskontrolle der bei jedem Messschritt aufgenommenen Bilder sowie der generierten Sensorgramme auf der Landingpage der automatisierten Analyse gelegt.
• Darüber hinaus bietet heliOS Werkzeuge zur Behebung von Unregelmäßigkeiten in Sensorgrammen während der manuellen Datenanalyse von scIC.

scIC-Datenanalyseprozess:

1. Bildprüfung:
   • Untersuchen Sie alle während der Messung aufgenommenen Bilder (Registerkarte „Bilder“ im Experimentfenster).
   • Wie viele Zellen blieben während der gesamten Messung stabil in den Fallen?
   • In welchem ​​Zustand befinden sich die Zellen? Prüfen Sie die Granularität und die Zellintegrität.
   • Sind die Fallen nach dem Regenerationsschritt sauber?
2. Rohdatenprüfung:
   • Untersuchen Sie die Rohdaten für Referenzpunkt 1 und Messpunkt 2.
   • Das Signal des Normalisierungspeaks sollte nahe am oder über dem höchsten Rohdatensignal liegen.
   • Kehrt das Signal an beiden Stellen auf den Ausgangswert zurück, oder gibt es Hinweise auf unspezifische Bindung?
3. Überprüfung normalisierter Daten:
   • Werden die Injektionssprünge für Punkt 1 und Punkt 2 korrekt übereinandergelegt?
4. Überprüfung der Referenzdaten:
   • Führt der Regenerationsschritt das Signal wieder auf den Ausgangswert zurück? Falls nicht, überprüfen Sie nach der Regeneration, ob sich Zellen oder Ablagerungen in den Fallen befinden.viewdie Bilder.
   • Gibt es in den genannten Kurven Ausreißer, Spitzenwerte oder andere Unregelmäßigkeiten? Falls ja, überprüfen Sie diese.view die Bilder, um mögliche Ursachen zu identifizieren und manuelle Anpassungen in Betracht zu ziehen.
5. Datenfit-Prüfung:
   • Durchführung einer visuellen Qualitätsbeurteilung
   • Beschreibt die Anpassung das Verhalten der Kurven korrekt, oder schneidet die Anpassungsgerade das Sensorgramm?
   • Beschreibt die Anpassung die Krümmung der Daten angemessen?
   • Ist das ampStimmt die Höhe mit den referenzierten Daten überein?

scIC Automatisierte Datenanalyse

• Die automatisierte scIC-Analyse verarbeitet Rohdaten mit nur wenigen Klicks zu Qualitätskontrolldiagrammen und angepassten Daten.
  1. Öffnen Sie ein scIC-Experiment, indem Sie in der Experimentliste auf das ausgewählte Experiment doppelklicken.
  2. Klicken Sie auf die große blaue Schaltfläche „Analysieren“ unten im Experiment-Tab.
  3. Wählen Sie im Experimentablauf den Test aus, den Sie analysieren möchten.
  4. Wählen Sie unter den verfügbaren Analysetypen „Kinetik scIC“ aus und klicken Sie auf „Weiter“.
     • NOTIZ: Wenn das Experiment noch läuft, werden in der Liste nur abgeschlossene Tests angezeigt. Sobald ein Test ausgewählt ist, werden im nächsten Fenster alle verfügbaren Analysetypen angezeigt, die für die verwendete Methode/den verwendeten Test spezifisch sind.
  5. Konfigurieren Sie die Analyse bei Bedarf im folgenden Fenster. Das Standard-Anpassungsmodell ist „Kinetik – Freier Endpegel“ mit aktiviertem Kontrollkästchen „Endpegel auf Null anpassen“. Weichen Sie von diesem Modell nur ab, wenn die biologischen Gegebenheiten oder die Daten eine komplexere Beschreibung erfordern.
  6. Sobald die Konfiguration abgeschlossen ist, klicken Sie auf Analysieren, um alle abgeleiteten Momentaufnahmen, Roh- und verarbeiteten Sensorgramme sowie Kinetikwerte anzuzeigen.
• Aufgrund der inhärenten Komplexität der sampBei Verwendung von les für scIC-Assays können die resultierenden Sensorgramme Unregelmäßigkeiten aufweisen.
• Um dem entgegenzuwirken, wird bei der automatisierten Analyse besonderer Wert auf die Qualitätskontrolle von Bildern und Sensorgrammen gelegt.
• Falls manuelle Korrekturen oder eine detailliertere Analyse erforderlich sind, stehen im Scratchpad für manuelle Analysen Werkzeuge zur Artefaktkorrektur zur Verfügung.

heliXcyto Wartung und Dekontamination

• Die Wartung von heliXcyto ist unerlässlich, um die optimale Leistung und Langlebigkeit des Instruments zu gewährleisten. Regelmäßige Wartung umfasst Reinigungsverfahren, die Verunreinigungen verhindern und die Integrität des Systems erhalten, um genaue Ergebnisse und einen reibungslosen Betrieb zu gewährleisten. Konsequente Pflege ist entscheidend für die Zuverlässigkeit des Instruments und die Qualität der experimentellen Ergebnisse.
  Die Wartung von heliXcyto umfasst zwei wichtige Verfahren: Cyto System Wash, das direkt in einen Testablauf integriert werden kann, und Clean & Sleep, das als separate Routine durchgeführt wird, um das Instrument direkt vor der Verwendung nach einer vorherigen längeren Messung über Nacht oder bei Nichtgebrauch für mehr als 2 Tage zu warten.
• Sowohl System Wash als auch Clean & Sleep erfordern das Vorhandensein eines heliX®-Wartungschips im Chipfach.

Reinigungs- und Schlafroutine

• Die Reinigungs- und Ruhezeitroutine dient der Reinigung und dem Abschalten/Lagern des Geräts. Dabei werden die Schläuche des heliX®-Geräts zunächst mit Reinstwasser und anschließend mit 70%igem Ethanol gespült. Abschließend werden alle Schläuche mit Luft entlüftet.
• Dieser Reinigungsvorgang ist vollautomatisch und dauert etwa 40 Minuten. Dabei wird das Ethanol in die Wasserflasche ausgestoßen; der Inhalt der Flasche muss anschließend entsorgt werden.
• Nach einer Reinigung und einem Ruhemodus wechselt das Gerät in den Ruhemodus und kann erst nach einer Aktivierung und Grundierung wieder verwendet werden. Für beide Vorgänge ist ein heliX® Wartungschip erforderlich.
• WICHTIG: Um eine Kontamination der Schläuche zu vermeiden, entsorgen Sie nach dem Reinigungsvorgang unbedingt den Inhalt der Wasserflasche (Wasser-/Ethanol-Gemisch) und leeren Sie den Abfallbehälter.

Außerbetriebnahme und Langzeitlagerung

• Bei längerer Nichtbenutzung entfernen Sie bitte nach dem Clean & Sleep-Verfahren die Flasche mit Wasser und Ethanol aus der Pufferschale und lassen Sie den Schlauch der Luft ausgesetzt.
• Nehmen Sie außerdem den heliX® Wartungschip heraus und bewahren Sie ihn im Originalbeutel auf. Dies verhindert Rückfluss und Verunreinigung. Schalten Sie das Gerät aus.

Zytosystem-Waschanlage

• heliXcyto System Wash reinigt das mikrofluidische System mit der Reinigungslösung 3 (CS3) in ca. 45 Minuten gründlich. Die CS3 wird in zwei s aufgenommentages. Erste Nadel und sampDie Schleife wird gefüllt und inkubiert, um alle Verunreinigungen zu entfernen.
• NOTIZ: Führen Sie mindestens täglich eine Cyto System Wash-Reinigung durch, wenn das Gerät in Gebrauch ist. Wir empfehlen, die Cyto System Wash-Methode in einen Assay-Workflow zu integrieren, entweder nach jedem Assay (beim Wechsel zu einer neuen Zelllinie oder wenn …).ampDie Qualität des Assays ist nicht optimal) oder bis zum Ende eines Assay-Workflows. Tauschen Sie den Wartungschip nach maximal 50 Cyto System Washes aus, die als Anzahl der Regenerationen im Chip-Tray angezeigt werden. view der Gerätesteuerung.

Kontakt

• Dynamic Biosensors GmbH
• Perchtinger Str. 8/10
• 81379 München
• Deutschland
• Bruker Scientific LLC
• 40 Manning Road, Manning Park
• Billerica, MA 01821

USA

• Bestellinformationen order.biosensors@bruker.com
• Technische Unterstützung support.dbs@bruker.com
• www.dynamic-biosensors.com
• Instrumente und Chips werden in Deutschland entwickelt und hergestellt.
• ©2025 Dynamic Biosensors GmbH
• Nur für Forschungszwecke. Nicht zur Verwendung in klinisch-diagnostischen Verfahren.

Häufig gestellte Fragen

Häufig gestellte Fragen zu scIC

Kann ich den HeliXcyto-Chip wiederverwenden?

Ja, der HeliXcyto-Chip ist wiederverwendbar und kann auch als Einwegprodukt verwendet werden. Bitte beachten Sie die entsprechenden Reinigungs- und Aufbewahrungshinweise.

Welchen Zweck hat der Wartungschip?

Der Wartungschip dient der Reinigung, Prüfung und Wartung, um die ordnungsgemäße Funktion des Systems sicherzustellen.

Wie oft sollte ich das Gerät reinigen?

Das Fluidiksystem von heliXcyto wird mit den Methoden Cyto System Wash und Clean&Sleep sauber gehalten. Es wird empfohlen, das Mikrofluidiksystem nach jedem Assay (insbesondere beim Wechsel des Zelltyps) oder spätestens am Ende eines Assay-Workflows mit Cyto System Wash auf einem Wartungschip zu reinigen. Die Clean&Sleep-Prozedur sollte unmittelbar vor der Verwendung nach einer vorangegangenen längeren Messung (z. B. morgens nach einem Experiment über Nacht) oder wenn heliXcyto länger als zwei Tage nicht verwendet wird, angewendet werden.

Wie lange können die Lösungen: RB 1 / Wasser / CS 1 / CS 3 / Normalisierungslösung in dem Gerät aufbewahrt werden?

Generell sind vor jeder Messung alle Lösungen auf Restvolumen sowie mögliche Trübung oder Ausfällung zu prüfen. In diesem Fall muss die Lösung sofort ausgetauscht werden. Wasser und RB 1 sind täglich zu wechseln, RB 1 ist vor jeder Messung zu filtrieren. Verdünnte Normalisierungslösung kann zwei Tage hintereinander verwendet werden. Reinigungslösungen sind etwa drei Tage haltbar.

Wie lange kann ich den HeliXcyto-Chip verwenden?

Das Verfallsdatum des heliXcyto-Chips kann im heliOS-Menü unter „Geräte“ im Tab „Chip-Tray“ überprüft werden. Nach Ablauf des Verfallsdatums kann keine Garantie für die Chipintegrität übernommen werden. Solange die Fallen jedoch stabil sind, die Oberfläche sauber ist und die Fluoreszenz unterhalb des im Chip-Test angegebenen Grenzwerts liegt, gilt der Chip als für Messungen verwendbar. Um die Lebensdauer des Chips deutlich zu verlängern, wird eine regelmäßige externe Chipreinigung (Chip-Reinigungskit CCK-1-1) nach jeder Verwendung empfohlen.

Wie lange kann ich den Wartungschip verwenden?

Der Wartungschip muss nach 50 Systemwäschen (die in der Gerätesteuerung unter dem Menüpunkt „Chip-Einschub“ in heliOS als Regenerationen gezählt werden) ausgetauscht werden.

Wie oft sollte der heliXcyto Chip Test durchgeführt werden?

Der Chip-Test erfasst Informationen über Fluoreszenzhintergrund, Sauberkeit und Integrität des Chips vor Beginn eines neuen Experiments. Er sollte mindestens einmal bei der Verwendung eines neuen Chips durchgeführt werden, idealerweise jedoch vor oder zu Beginn jedes Experiments, um den Zustand des Chips zu überprüfen. Dadurch können die Messbedingungen angepasst und Anomalien in den Sensorgrammen dem Chip oder dem Gerät zugeordnet werden.

Was ist die Chemie der Analytmarkierung?

Unsere Markierungskits koppeln rote bzw. grüne Fluoreszenzfarbstoffe über NHS-Ester an primäre Amine in Proteinanalyten (z. B. Lysine oder N-Terminus). Details und Hinweise zur Fehlerbehebung finden Sie in den Handbüchern unserer heliXcyto Markierungskits für rote Farbstoffe (Labeling Kit red dye 2 CY-LK-R2-1) und grünen Farbstoffe (Labeling Kit green dye CY-LK-G1-1). webGeschäft.

Wo finde ich die Zugangsdaten und Lizenzinformationen für heliOS?

Die Eingabe der Zugangsdaten und Lizenzinformationen wird im Abschnitt „heliOS-Installation“ des heliXcyto-Leitfadens von unserem [Anbieter/Unternehmen] beschrieben. webWebsite (heliXcyto-Anleitung). Ihre Lizenzinformationen sollten im Ordner „scIC“ auf dem heliXcyto-PC-Desktop gespeichert sein, den unser Anwendungsspezialist während der Schulung erstellt hat.

Was sind die Anregungs-/Emissionsbereiche von heliXcyto?

Anregung im roten Bereich: 605–625 nm, Emission (Detektion): 655–685 nm. Anregung im grünen Bereich: 490–510 nm, Emission im grünen Bereich: 525–575 nm.

Wie oft muss ich dasselbe Experiment durchführen, um statistische Aussagekraft zu erhalten?

Um verlässliche mittlere Kinetikraten zu erhalten, werden 3–4 Wiederholungen von Kinetikmessungen mit drei Konzentrationen in einer homogenen Zellpopulation empfohlen. In einem konsistenten Datensatz sollten die Assoziations- und Dissoziationsraten der Replikate innerhalb eines 2–4-fachen Zeitfensters liegen.

Wie empfindlich sind scIC-Messungen?

Die untere Nachweisgrenze für die Zielexpression hängt von der Analytmarkierung ab, aber typischerweise kann scIC bereits mit nur 1000–10000 Molekülen pro Zelle die Kinetik messen. Um die Sensitivität zu erhöhen, wird empfohlen, mindestens 5 Zellen zu erfassen und die Analytkonzentration (DOL) von 5–10 sowie die LED-Leistung so einzustellen, dass maximale Fluoreszenzwerte erzielt werden.

Was sind die Nachweisgrenzen des HeliXcyto-Systems in Bezug auf kinetische Raten?

Die aktuellsten technischen Daten zu heliXcyto finden Sie in den technischen Spezifikationen des Geräts (heliXcyto-Handbuch). Dissoziationskonstante Kd: 10 pM bis 1 mM; Assoziationsgeschwindigkeitskonstante kon: 1E3 bis 1E7 M⁻¹s⁻¹; Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante koff: 1E-6 bis 1 s⁻¹. Weitere Informationen finden Sie in unserem heliXcyto-Handbuch. webWebsite.

Dokumente / Ressourcen

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Verweise

• Bedienungsanleitung